OZANON Michaël
Dosages d’interleukines chez l’humain et la souris
25-28 rue du Docteur Roux
PARIS XV
Remerciements
Je remercie le professeur Bernard DAVID de m’avoir accueilli dans l’unité d’Immuno-Allergie à l’Institut Pasteur de Paris.
J’adresse mes sincères remerciements à Jean-Marc CAVAILLON pour ma parfaite intégration au sein de son équipe de recherche et tout le temps qu’il m’a consacré.
Je tiens à exprimer ma profonde gratitude à Catherine FITTING pour sa disponibilité de tous les instants, ses précieux conseils et sa grande patience. Merci d’avoir rendu ce stage si passionnant et agréable.
Je remercie également Minou, Naïma et Fabienne pour leur bonne humeur, leurs généreuses et utiles explications.
Un grand merci, enfin, à toute l’équipe d’Immuno-Allergie qui m’a témoigné beaucoup de sympathie tout au long de mon stage.
Sommaire
Introduction : *
A Partie Economie-Gestion *
I Présentation de l’institut *
Activités *
Le personnel *
Les syndicats *
Le Comité d’Entreprise *
Hygiène, sécurité, environnement *
II Le budget *
Financement *
Dépenses *
B Partie Scientifique *
I étude de la production de TNF dans différents compartiments cellulaires témoins, après injection de LPS ou de NaCl chez des souris surrénalectomisées. *
Introduction : *
1- Protocole de l’expérience : *
2- Mode opératoire : *
II Dosage par la technique ELISA (Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay) : *
Mode opératoire : ELISA mise au point au laboratoire *
III Dosage de cytokines présentes dans le plasma de patients ayant subi un arrêt cardiaque. *
1- Intérêt : *
2- Mode opératoire : *
IV Récupération de différentes cellules à partir de sang humain " sain " *
1- Récupération des cellules mononucléées : *
2- Récupération des cellules polynucléées : *
V Résultats expérimentaux *
Conclusions : *
I Conclusion sur les résultats scientifiques : *
1- Dosage du TNFa : *
2- Malades Arrêt cardiaque : *
II Conclusion personnelle / Générale sur le stage : *
Introduction :
Grâce aux travaux de Louis Pasteur, une souscription internationale est lancée par l’Académie des Sciences. Elle recueillera une somme importante qui lui permettra de fonder, en 1887, l’institut qui porte son nom. Celui-ci est inauguré le 14 novembre 1888. A l’origine, l’Institut Pasteur devait être un dispensaire pour le traitement de la rage, un centre d’étude pour les maladies virulentes et contagieuses et enfin, un centre d’enseignement. L’Institut Pasteur deviendra au fil des ans, l’un des tous premiers centres internationaux de recherche en biologie. En plus d’un siècle, des découvertes majeures y ont vu le jour et ont permis de considérables avancées en santé publique.
L’Institut Pasteur se situe au 25-28 rue du Docteur Roux à Paris XVème. Le laboratoire dans lequel j’ai effectué mon stage se trouve dans le bâtiment d’Immuno-Allergie (Annexe A1 : plan de l’Institut) qui reçoit également au rez-de-chaussée la consultation d’allergologie. Ce bâtiment ne comprend que des laboratoires de classe II répartis sur 3 étages. Le travail y est effectué sous hotte à flux laminaires protégeant la manipulation et, pour la plupart, l’opérateur. Cette unité se compose de 5 groupes travaillant sur des thèmes différents. Mon laboratoire d’accueil, situé au 3ème étage, concentre plus particulièrement sa recherche sur la production de cytokines dans les pathologies inflammatoires et/ou infectieuses. J’y ai travaillé en secondant une technicienne supérieure de laboratoire, Mlle FITTING, réalisant les expériences sous le contrôle du chef de laboratoire, le Dr CAVAILLON.
A Partie Economie-Gestion
L’Institut Pasteur a été pour permettre à Louis Pasteur d’étendre la vaccination contre la rage, de développer l’étude des maladies infectieuses, et de diffuser les connaissances.
Parallèlement à l’essor de l’Institut Pasteur proprement dit, se constituera un réseau d’instituts à travers le monde, qui compte aujourd’hui quelques 23 instituts et établissements associés.
L’Institut Pasteur poursuit son œuvre en faveur de la santé publique, en France et dans le monde, à travers la lutte contre les maladies infectieuses, contre le cancer, contre les maladies génétiques, et les maladies dégénératives ou neurologiques, par exemple.
Fidèle à l’esprit pasteurien, l’Institut dispense par ailleurs des enseignements de haut niveau correspondant à des disciplines en plein développement, dispensés par des spécialistes de chaque discipline et faisant largement appel à l’enseignement pratique.
L’hôpital de l’Institut Pasteur, qui a fermé le 31/12/99 malgré la qualité des conditions d’hospitalisation et des soins, était notamment spécialisé dans les maladies infectieuses tropicales et immunitaires.
Enfin, l’institut est une véritable petite ville avec sa déchetterie et ses nombreux corps de métiers internes (ex : menuisiers, plombiers, serruriers, électriciens…).
Effectifs travaillant sur le campus au 31.12.98
IP : Institut Pasteur * Equivalent temps plein de 949 stagiaires OPR : Organismes Publics de Recherche (personnels rémunérés par le CNRS, l’INSERM,…)
Près de 2700 personnes travaillaient à l’Institut Pasteur en 1998 regroupant des chercheurs, des ingénieurs, des techniciens, et des administratifs provenant de l’Institut Pasteur ou d’organismes publics de recherche (CNRS, INSERM, …), ainsi que des stagiaires ; une population relativement stable mais dont l’analyse met en avant le renforcement de l’effectif salarié de l’Institut. Une tendance qui s’explique par la politique de recrutement de jeunes chercheurs décidée en 1995. Renouvelée cette année encore, elle doit permettre d’accroître le nombre des chercheurs rémunérés par l’Institut Pasteur tout en assurant l’encadrement futur des unités de recherche. Cette évolution des effectifs, dans un contexte national pourtant difficile, a permis de créer environ 200 emplois en dix ans.
L’accueil des stagiaires, universitaires ou collégiens, toujours très nombreux, reste aussi l’une des priorités de l’institut. Cet accueil est facilité par les possibilités d’hébergement qu’offre, le temps d’un stage (même de courte durée), la récente résidence des stagiaires qui accueille chaque année plus de trois cents stagiaires.
Un autre aspect de cet accueil est constitué par le dispositif de tutorat (depuis 1997) destiné à faire parrainer par des chercheurs permanents de jeunes scientifiques préparant une thèse au sein du campus.
L’Institut Pasteur est administré par un Conseil d’Administration qui nomme le Directeur (Annexe A2 : organigramme de l’Institut). Ce dernier est chargé du fonctionnement de l’Institut et est assisté d’un Conseil Scientifique dont il sollicite les avis pour la conduite de la politique scientifique. Une assemblée d’une centaine de membres procède à l’élection des membres du Conseil d’Administration, qui lui soumet un rapport annuel sur l’activité de l’Institut (Annexe A3 : Rôles des Directions). Un nouveau directeur général, Mr Kourilsky, ayant été nommé le 6 janvier 2000, une restructuration complète des différentes directions est en cours.
Mais, au sein de chaque unité, il existe également une hiérarchie ; en ce qui concerne l’unité dans laquelle je me trouvais, on peut établir l’organigramme suivant :
Chaque stagiaire est rattaché à un scientifique qui n’est pas forcément le chef d’unité. Le laboratoire 301 dans lequel j’ai effectué mon stage regroupe, pour l’année 2000, un Chef de laboratoire, un assistant, un technicien, un DEA, une thèse (en 3ème année) et un post-Doctorat.
Au sein de l’Institut Pasteur, nous pouvons compter 5 syndicats différents :
Depuis l’ordonnance du 22 février 1945 (complétée par la loi du 16 mai 1946), les entreprises comptabilisant plus de 50 employés sont tenues d’organiser un Comité d’Entreprise. Le C.E. de l’Institut fut fondé en octobre 1945 et, a entre autre, deux missions définies par des articles
du code du travail :
Pour mener à bien ces missions, le C.E. à trois fonctions essentielles : l’information, la consultation et la décision. Les deux premières s’exercent dans le cadre de ses attributions économiques, la troisième dans le cadre de ses attributions sociales et culturelles.
Pour fonctionner, le CE reçoit deux subventions directement par l’Institut Pasteur :
Tous les mois, le Comité est réuni au moins une fois sur convocation du Président, M. GEORGE, Directeur des Ressources Humaines.
Les activités proposées sont très diverses avec des réductions chez un prestataire de photographie, des voyages organisés à tarifs attrayants, des colonies de vacances, des bons d’achat rentrée scolaire ou à Noël, une médiathèque, une subvention pour la cantine,…
Hygiène, sécurité, environnement
Environnement :
Sur un campus aussi vaste que celui de l’Institut Pasteur où sont conduites des activités très diverses, les questions d’hygiène, de sécurité, d’environnement et d’une manière générale, de prévention, mobilisent toutes les attentions. Ainsi, l’année 1998 a-t-elle été marquée par des réflexions sur plusieurs sujets importants dont la sécurité informatique et l’amélioration du cadre de travail.
A l’heure où les communications informatiques prennent une place prépondérante, une attention toute particulière a été portée sur l’utilisation des systèmes informatiques utilisés par les scientifiques afin de maintenir un bon équilibre entre ouverture vers l’extérieur et confidentialité des communications.
L’année 1998 a aussi été celle du lancement de " labo propre ", opération de grand nettoyage des départements de recherche destinée à jeter, ranger, archiver ou recycler tout ce qui n’est plus nécessaire dans les laboratoires et dont la présence peut très vite devenir une gêne au cadre de travail.
Les résultats attendus sont bien là avec une amélioration du cadre de vie professionnelle et des conditions de sécurité. L’implication des pasteuriens (équipes des services Hygiène, Sécurité, Protection de l’Environnement, Matériel scientifique et Archives) explique le succès de cette opération qui répond à trois objectifs : respect de l’environnement, des règles d’hygiène et de sécurité et réduction des coûts de la filière déchets. Cette opération se poursuit tout au long de l’année 2000.
L’année 1999 a vu la fin du grand chantier de construction d’un immeuble à usage de locaux sociaux qui accueille également une zone de restauration, des salles de réunion, de formation et les services d’Hygiène-Sécurité, Protection de l’Environnement et médecine du travail.
Enfin, pour l’année 2000, la mise en place de badges magnétiques d’accès se généralise pour tous les bâtiments conjointement à un système de pointage des non-cadres suite au passage aux 35 heures.
Hygiène-sécurité
La désignation du personnel est effectuée par un collège composé par les membres élus du comité d’entreprise et les délégués du personnel. La jurisprudence confirme que les membres représentant le personnel au C.H.S.C.T. (Comité d’Hygiène et Sécurité et des Conditions de Travail) sont élus au scrutin de liste avec représentation proportionnelle à la plus forte moyenne.
Le C.H.S.C.T. a pour mission de contribuer à la protection de la santé et de la sécurité des salariés ainsi que ceux mis à la disposition de l’Institut par une entreprise extérieure, y compris les travailleurs temporaires. Il a également pour mission de veiller à l’observation des prescriptions législatives et réglementaires prises en ces matières, de visiter les lieux de travail, …
La prévention des risques se fait grâce à la mise en place d’un réseau de correspondants de sécurité (1 par unité) qui quadrille le campus depuis 1990. Les nouvelles formations aux risques professionnels concernent plusieurs centaines de personnes. D’autres actions témoignent de la même préoccupation : le suivi médical, depuis 1992, des personnes travaillant sur le campus, le programme contre le tabagisme lancé en 1993 par les Médecins du Travail.
Chaque personne, quel que soit son statut, se doit d’avoir été informée sur les risques en laboratoire avant de travailler à l’Institut Pasteur. Pour ce, des stages de durées variables selon le type de poste occupé, sont organisés et obligatoires lors de l’arrivée de toute personne ayant à travailler sur le Campus.
II Le budget
Après une quinzaine d’années de croissance soutenue de son potentiel de recherche, l’Institut Pasteur a abordé, il y a 5 ans, une période caractérisée par une faible progression de ses ressources. Ce ralentissement est perceptible depuis 1995 et les comptes pour 1998 confirment cette tendance puisque le montant des ressources courantes de l’Institut est pour la première fois depuis longtemps inférieur à celui de l’année précédente. En 1997, ce montant s’élevait à 1 016 000 000 de francs contre 1 005 000 000 de francs en 1998.
Le mécénat représente près de ¾ de cet ensemble.
Depuis sa création en 1887, l’Institut Pasteur a toujours été financé en partie grâce au mécénat. C’est à dire par les dons, legs et subventions des particuliers et des personnes morales (par exemple la BNP, Elf-Aquitaine,…). Cet élan de générosité international a permis le développement de l’Institut au fil des ans. Fondation privée, l’Institut Pasteur accepte les soutiens financiers de personnes physiques ou morales et peut aussi les faire bénéficier des avantages fiscaux liés à la reconnaissance d’utilité publique : exonération des droits de succession pour les legs, réduction d’impôts pour les dons.
Les produits du patrimoine, qui représentent en 1998, 7% de l’ensemble des ressources de l’Institut regroupent les produits financiers courants, les loyers et les produits agricoles.
Pour le laboratoire 301, le budget 1999 était de 340 000 francs. Il se décompose de la façon suivante :
Pour 2000, le budget de fonctionnement du laboratoire s’élève à 230 000 Francs et se décompose comme suit :
En 1998, les dépenses courantes s’élèvent à 998 millions de Francs et se répartissent comme suit :
Ces dépenses couvrent surtout les activités de recherche de l’Institut puisque ces dernières représentent 81% des dépenses totales ; les activités d’enseignement interviennent pour 2% dans ce total et les activités de service public (centres de référence, collections,…) pour 5%. Le complément correspond aux coûts des activités productrices de revenus (expertises, biologie médicale spécialisée…) pour 11% et le coût de la collecte de fond est de 1%.
La répartition des dépenses de recherche par département scientifique est présentée sur le graphique suivant :
Depuis sa création, l’Institut Pasteur a toujours consacré une part importante de ses moyens à la recherche sur les maladies infectieuses et leur mode de transmission. Les départements de virologie, du SIDA et rétrovirus, de bactériologie représentent plus de la moitié des coûts de recherche pasteurienne. Mais la physiopathologie, avec 13%, représente aussi une part importante. De nouvelles disciplines tendent également à se développer comme la biologie moléculaire par exemple.
Pour le laboratoire 301, le coût des expériences est conséquent du fait du prix des produits utilisés et du matériel nécessaire. Le prix de 1 mg d’une cytokine comme l’interleukine 10 (IL-10) est, par exemple, de l’ordre de 300 000 Francs, celui d’un kit commercial E.L.I.S.A. Humain prêt à l’emploi (96 puits) est de 3 500 Francs environ même si, en réalisant des traductions de protocoles pour le fournisseur, des réductions importantes ont été accordées au laboratoire.
Du fait du coût élevé des produits, le travail est effectué sur de très petites quantités de l’ordre du µl. Pour pouvoir prélever ces volumes avec précision et garantir une reproductibilité correcte, l’utilisation de micro-pipettes électroniques est nécessaire. (Annexe B1 : Pipettes Biohit® ) Mais ces pipettes, bien qu’indispensables, sont assez onéreuses ( 6100 Francs pour une pipette multi-canaux, par exemple).
B Partie Scientifique
Cette étude porte sur la production d’une cytokine, le Tumor Necrosis Factor (TNF), par différents types cellulaires chez la souris après stimulation avec différents produits bactériens (Lipopolysaccharide (LPS) ou germes tués de staphylocoques (SAC)).
Au cours d’une infection locale ou généralisée, la majorité des gènes codants pour les cytokines sont exprimés. Certaines cytokines comme le TNF et l’IL-1 jouent un rôle prépondérant dans le processus inflammatoire bien que d’autres (IL-8, IL-6, IL-10,…) soient également impliquées. En fonction de plusieurs paramètres (concentration, temps d’apparition,...), les cytokines peuvent avoir un rôle bénéfique ou délétère pour l’hôte. Le TNF a premièrement un rôle pro-inflammatoire. Il peut exercer son action de façon autocrine (activation/inhibition sur la cellule sécrétrice), paracrine (activation/inhibition sur les cellules environnantes) ou endocrine (déversée dans le sang). A faible concentration, le TNF semble bénéfique en " orchestrant " les événements lors d’une inflammation localisée. A forte concentration il peut être à la source de la destruction tissulaire ou même de choc létal.
Expérimentalement, du TNF est produit in vitro par les cellules de la lignée monocytaire ainsi que par d’autres cellules, en réponse à une exposition au lipopolysaccharide bactérien (LPS). Le TNF apparaît avant toute autre cytokine après l’injection et atteint une concentration maximale après 1 à 2 heures.
Le LPS, de structure lipidoglucidique, provient de la membrane externe de bactéries à Gram négatif. Suivant les bactéries, sa structure est plus ou moins différente (fig. 2,3).
Il possède la capacité d’activer le système du complément par la voie alterne grâce à sa région polysaccharidique mais aussi la voie classique grâce au lipide A.
De même, le LPS induit la prolifération de lymphocytes B spléniques et des ganglions. Il est également à l’origine d’une activation polyclonale qui s’accompagne de la sécrétion d’IgM et stimule les plaquettes, les cellules endothéliales et les neutrophiles. En définitive, le TNF (entre autres), est produit en abondance lors de l’activation des monocytes/macrophages par le LPS.
L’injection massive (100 µg) de LPS une à trois heures avant le prélèvement des cellules joue certainement un rôle de tolérisation pour les cellules mises de nouveau, par la suite, en présence d’endotoxines. Le phénomène de tolérance a déjà été observé sur des cellules du sang périphérique.
Il correspond à un état d’anergie des cellules qui ne répondent plus en terme de production de cytokine à un second stimulus lorsqu’elles ont été activées une première fois par le LPS.
Ce phénomène n’est pas spécifique aux endotoxines mais les mécanismes qui régissent cet état d’hyporéactivité au LPS restent encore inconnus. On recherche si ce phénomène de tolérance est retrouvé dans d’autres types de cellules que les cellules sanguines.
Les glucocorticoïdes sont utilisés lors de thérapies pour leur effet vraisemblablement favorable sur l’inflammation. On recherche à connaître ce rôle sur les différents types cellulaires. Or, le TNF va entraîner la production, par l’hypothalamus, de CRF (cortico-releasing factor) qui agit sur les cellules de l’hypophyse pour leur faire produire l’hormone adrénocorticotrope (ACTH). Cette dernière, agissant sur les surrénales, est responsable de la production des glucocorticoïdes (puissants inhibiteurs de la production de cytokines) schéma 4. Le TNF est donc ainsi à l’origine d’une boucle de rétro-inhibition. L’utilisation de souris surrénalectomisées permettra d’observer si ce rétro-contrôle agit de la même façon dans tous les compartiments étudiés.
1- Protocole de l’expérience :
L’expérience consiste à étudier la production de TNF chez des souris surrénalectomisées ou témoin après injection de NaCl ou de LPS. On étudiera la production de cytokines dans différents compartiments cellulaires :
Pour cela, différents groupes de souris sont nécessaires :
- 1 groupe de souris témoins qui n’auront pas subi d’opération
- 1 groupe de souris témoins opération (ce groupe de souris n’a subi que l’opération pour vérifier l’impact de l’acte chirurgical seul qui est sans doute déjà facteur de stress pour les animaux par rapport au groupe non opéré)
- 1 groupe de souris surrénalectomisées
Chaque groupe de souris subit 2 types d’injection :
- témoin injection de NaCl pendant 1 ou 3 heures (en effet, le fait d’injecter un volume très important de NaCl (0,1 ml de NaCl 9% dans un volume sanguin de 2 ml) et la piqûre en elle-même peuvent aussi être source de stress).
- test injection LPS pendant 1 à 3 heures (afin de tester l’effet d’un premier contact avec l’endotoxine.
Chaque groupe de souris est constitué de 4 animaux. Tous les prélèvements pour un même type cellulaire sont " poolés ". Chaque souris est sacrifiée par dislocation cervicale et les différents organes et cellules sont prélevés.
Prélèvement des macrophages péritonéaux :(annexe B2 photos n° 3 à 6)
Prélèvement des macrophages alvéolaires : (annexe B3 photos n° 9 à 13)
Prélèvement des cellules spléniques : (annexe B2 photo n° 8)
Prélèvement de cellules de la moelle osseuse :(annexe B3 photos n°14 à 16)
Puis, (voir schéma suivant), compléter tous les tubes à 50 ml avec du RPMI.
On centrifuge ensuite ces prélèvements à 1000 tr/mn (15°C pendant 10 mn). Après élimination du surnageant, le culot cellulaire est resuspendu dans un volume précis de RPMI :
Macrophages alvéolaires : dans 0,5 ml
Macrophages péritonéaux : dans 1 ml
Cellules spléniques : dans 10 ml
Cellules de la moelle osseuse : dans 1 ml
On réalise ensuite un dénombrement en cellule de Malassez après dilution dans un colorant vital (Eosine 1/1000).
Chaque type cellulaire est amené à une concentration par ml en tenant compte des conditions expérimentales qui sont de 1% de sérum de veau fœtal en présence ou absence d’indométhacine. L’indométhacine est utilisée pour inhiber la voie de la cyclo-oxygénase qui inhibe la production du TNFa mais pas de l’IL-6 (l’IL-6 étant une cytokine de l’inflammation qui sera dosée ultérieurement).
Chaque surnageant est aliquoté en 2 petits tubes qui sont congelés à la température de -40°C jusqu’au dosage des cytokines.
II Dosage par la technique ELISA (Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay) :
L’ELISA est un test immuno-enzymatique développé dès 1971 et permettant de révéler et de quantifier la présence d’un Ag dans différents milieux, surnageant de culture ou sérums par exemple. Ici c’est la présence des cytokines que l’on recherche. Dans le cadre de mon stage, il a été réalisé plusieurs ELISA comprenant des trousses de dosage commerciales ou mises au point au laboratoire.
Mode opératoire : ELISA mise au point au laboratoire
On place une solution d’Ac spécifiques (monoclonaux) dans les puits pendant 1 nuit à 4°C. Il y a fixation de ceux-ci, par simple absorption physique au plastique (adsorption) ou par liaisons covalentes. L’anticorps est mis en quantité précise (ex : 5µg / ml) afin d’avoir un rendement maximum. Pour cela on a réalisé au préalable une courbe de titration afin de déterminer pour quelle concentration en Ac la fixation sera suffisante et aura le meilleur rendement.
Il s’agit d’Ac très spécifique.
On effectue plusieurs lavages pour éliminer les Ac en excès. On utilise pour cela une solution contenant du Tween qui permet aux Ac non fixés de " glisser " et d’être ainsi facilement éliminés.
Pour éviter que les Ag ne se fixent au plastique, on sature les puits avec de la Sérum Albumine Bovine. On peut remplacer la SAB par de la SA Humaine, de la gélatine, ou même du lait écrémé (par souci d’économie).
Incuber environ 2 heures à 37°C ou une nuit à 4°C.
On réalise une dilution du surnageant contenant la cytokine à doser car les échantillons sont en très petites quantités et donc à économiser. La dilution est choisie selon des critères empiriques (expérience du dosage, littérature publiée,…). Pour quantifier cette cytokine, on réalise en parallèle une courbe de titration avec un étalon de cette cytokine. Les dilutions de ce standard sont réalisées en série afin de limiter les erreurs entre les points de la gamme.
On met donc l’Ag (cytokine) dans les puits. Il y a formation d’un complexe Ag-Ac entre la partie Fab de l’Ac et un des épitopes spécifiques de l’Ag.
Placer la plaque 2 heures à 37°C ou 1 nuit à 4°C.
On fixe un second Ac polyclonal (de lapin) spécifiques à d’autres épitopes de l’Ag que celui reconnu par le premier Ac.
Placer la plaque 1 heure et 30 minutes à 37°C ou une nuit à 4°C
On utilise des Ac polyclonaux plus faciles à préparer et moins chers que les Ac monoclonaux et qui ont aussi une grande possibilité de reconnaissance d’épitopes différents.
Des Ac marqués viennent se fixer sur le site Fc des Ac polyclonaux (1 heure à 37°C).
Il est en effet plus pratique au laboratoire d’acheter des Ac marqués se fixant sur la partie Fc des seconds Ac que de marquer soi-même les Ac polyclonaux (manipulation non rentable et offrant des résultats médiocres à petite échelle de production)
Ces 3ème Ac sont couplés à une enzyme. On met donc dans les puits une quantité déterminée de substrat (chromogène) et on laisse la réaction se développer pendant un temps très précis variant en fonction du marqueur et du chromogène.
Arrêt par un acide fort (HCl, H2SO4) à forte concentration (2 ou 3 Molaire) qui dénature l’enzyme.
On utilise un spectrophotomètre totalement informatisé capable de lire les plaques. L’intensité de la coloration est proportionnelle à la quantité d’antigène complexée. L’absorbance obtenue pour chaque échantillon est reportée sur la courbe de titration (informatisée) pour déterminer quelle est la quantité de cytokine contenue dans l’échantillon. Ce type d’ELISA, mis au point au laboratoire, est en permanente évolution dès lors que l’un des produits le composant doit être renouvelé. On doit alors le restandardiser (recalibrer les concentrations des Ac) pour pouvoir corréler les résultats d’années en années.
Le coût pour 96 puits est d’environ 200 Fr pour un ELISA mis au point au laboratoire.
Cependant, un inconvénient majeur limite cette méthode : selon la trousse de dosage, on ne peut pas doser dans tous les milieux.
III Dosage de cytokines présentes dans le plasma de patients ayant subi un arrêt cardiaque.
On travaille sur des échantillons de plasma de patients ayant subi un arrêt cardiaque à la suite d’un infarctus par exemple. Ces patients sont transférés dans un service de réanimation. Selon la durée de l’arrêt cardiaque, les conséquences pour le patient sont différentes. Une des réactions induites par un arrêt cardiaque d’au moins 30 minutes est comparable à une réaction de type " sepsis-like " (syndrome septique sévère accompagné d’une dysfonction d’organe et/ou d’une hypotension persistante et dont le pronostic vital est sombre). Lors de cette pathologie, il y a production et libération, par certaines cellules, de cytokines de l’inflammation, absentes dans le plasma des sujets sains.
Les plasmas prélevés sont stockés, jusqu’à leur dosage, à – 40°C en tube Eppendorf. Pour chaque patient, et selon son devenir, un suivi est réalisé dans les mêmes conditions (même heure,...) afin d’avoir des résultats cohérents.
On cherche, dans cette expérience, à déterminer quelles cytokines ont été produites à la suite de l’arrêt cardiaque (représentant un " stress " par manque d’oxygène pour les cellules) par rapport aux cytokines produites à la suite d’une septicémie (patients septiques témoins).
Ici, on utilise des trousses de dosages commerciales qui ont pour avantage d’être simples à utiliser (1), rapides à réaliser (2) et de ne pas interférer avec les différentes matrices des milieux à doser (3). Cependant, leur utilisation se révèle coûteuse à l’emploi (3300 Fr. pour 96 puits).
Plusieurs cytokines ont été dosées, IL-8, IL-10, IL-1ra, IL-6, TNFa , TNF RII.
IV Récupération de différentes cellules à partir de sang humain " sain "
Le but est de séparer en fonction de leur densité et récupérer en bon état différentes populations cellulaires (à savoire les cellules polynucléées, les cellules mononucléées et les globules rouges) du sang total de donneur sain.
1- Récupération des cellules mononucléées :
On utilise pour cette séparation un milieu d’une densité de 1,077, spécifique à la récupération des cellules mononucléées (tels que les monocytes et les lymphocytes).
A partir d’un échantillon de sang total (provenant d’un don de l’agence française du sang), on réalise une dilution au demi en RPMI (milieu nutritif permettant la survie des cellules).
Dans un tube conique en polypropylène (qui évite l’adhérence des cellules sur les parois lors des centrifugations), on dépose délicatement le sang sur le milieu de séparation de façon à éviter le mélange.
On centrifuge ensuite le tube 20 minutes à 1500 tr/min.
On obtient alors :
L’anneau contenant les cellules mononucléées est prélevé (en évitant de prendre du milieu de séparation ou du plasma en trop grande quantité) et déposé dans un tube conique dans lequel sera ajouté du RPMI pour effectuer les lavages.
Le premier lavage consiste à éliminer le milieu de séparation ainsi que le plasma. On procède par centrifugation pendant 5 minutes à 1500 tr/min. On retourne ensuite le tube de façon à éliminer le surnageant et à ne conserver que le culot cellulaire.
Le second lavage, toujours en présence de RPMI, consiste à éliminer les plaquettes. Pour ce faire, le tube est centrifugé 10 minutes à 1000 tr/min. puis élimination du surnageant.
On ajoute enfin du RPMI au culot cellulaire, on réalise une numération cellulaire et ensuite, les cellules peuvent être mises en culture.
2- Récupération des cellules polynucléées :
Pour cette séparation, on utilise tout d’abord du glucose dextran afin de séparer les globules rouges des autres cellules du sang. Pour cela on place dans un tube conique fin (1cm de diamètre) en polypropylène 10ml de sang total et 2 ml de glucose dextran. On laisse ensuite sédimenter 30 à 60 minutes jusqu’à formation de 2 couches distinctes : dans le fond du tube les globules rouges, au-dessus, d’un aspect jaune orangé (car contaminé en globules rouge), le plasma contenant toutes les cellules de la lignée blanche, les plaquettes et le glucose dextran.
On récupère la partie surnageante que l’on dilue au ½ en RPMI.
On réalise ensuite, comme pour les cellules mononucléées, une sédimentation sur milieu de densité 1,077 en tube conique large. On accélère la séparation des cellules par centrifugation.
On obtient alors différentes couches cellulaires :
On récupère le culot en vidant le tube par retournement puis par dissolution du culot cellulaire en RPMI.
V Résultats expérimentaux
étude de la production de TNF dans différents compartiments cellulaires témoins, après injection de LPS ou de NaCl chez des souris surrénalectomisées :
Légende:
S-O : " Sham-operated " : Souris contrôle
AD : " Adrenalectomised " : Souris surenalectomisées
Graphique représentant la quantité de TNFa produite par les cellules de la moelle osseuse 1 heure après les injections de NaCl ou LPS
Cellules de la moelle osseuse
1 heure après injection, on ne constate pas de différence majeure entre les souris naïves, S.O. et AD. et ceci quelle que soit l’injection effectuée.
Par contre, les cellules de la moelle osseuse, récupérées 3 heures après injection de LPS, ne sont plus capables de produire de TNFa après une stimulation in-vitro par du LPS, alors que les souris ayant reçu du NaCl sont toujours capables d’en produire.
Ce phénomène est connu sous le terme de " Tolérance aux endotoxines ".
Graphique représentant la quantité de TNFa produite par les cellules de la moelle osseuse 3 heures après les injections de NaCl ou LPS
Graphique représentant la quantité de TNFa produite par les cellules spléniques 1 heure après les injections de NaCl ou LPS
Cellules de la rate
1 heure après injection :
Pas de différences de réponse pour les souris S.O. naïves, NaCl 1h et LPS 1h lorsque les cellules spléniques sont de nouveau stimulées avec du LPS.
Dans le groupe des souris AD., on constate une diminution de la production de TNFa pour les souris injectées NaCl et LPS contrairement aux souris naïves.
3 heures après injection :
On constate la même réponse pour les souris que précédemment, mais de façon plus accentuée.
Pour les souris S.O., seules celles injectées de LPS semblent ne plus être capables de produire du TNFa .
Graphique représentant la quantité de TNFa produite par les cellules spléniques 3 heures après les injections de NaCl ou LPS
Graphique représentant la quantité de TNFa produite par les macrophages alvéolaires 1 heure après les injections de NaCl ou LPS
Macrophages alvéolaires
Pas de différence significative quel que soit le type de souris ou d’injection pour ce compartiment en terme de production de TNF a .
Graphique représentant la quantité de TNFa produite par les macrophages alvéolaires 3 heures après les injections de NaCl ou LPS
Graphique représentant la quantité de TNFa produite par les macrophages péritonéaux 1 heure après les injections de NaCl ou LPS
Macrophages péritonéaux
Pour les souris AD., il semble que l’injection in-vivo de LPS (pendant 1 et 3 heures) accentue la réponse des macrophages péritonéaux en ce qui concerne la production de TNFa après stimulation in-vitro par du LPS.
Pour les souris S.O. on ne constate pas de différence pour la durée 1 heure alors que pour la durée 3 heures, on observe une diminution de la production de TNFa que ce soit pour les souris injectées de NaCl comme pour celles injectées de LPS.
Graphique représentant la quantité de TNFa produite par les macrophages péritonéaux 3 heures après les injections de NaCl ou LPS
Conclusions :
I Conclusion sur les résultats scientifiques :
De part la complexité de ces expériences, aucune conclusion ne peut être envisagée sur les résultats d'une seule expérience. A ce jour, trois expériences ont été effectuées. Le bilan, nous montre une très grande hétérogénéité de réponses pour un même point. Il ressort tout de même une différence quant à la réponse des cellules après stimulation avec le LPS dans 2 compartiments (moelle osseuse et macrophages péritonéaux) entre les 2 groupes de souris après injection de LPS vs NaCl et au temps 3 heures. Il est donc envisagé de renouveler ces expériences pour accumuler des résultats, mais en incluant un groupe supplémentaire de souris dit souris naïves. Ces souris ne seraient donc ni opérées ni injectées. Il est apparu qu'il serait plus judicieux d'évaluer les résultats des expériences sur les souris opérées par rapport à ce groupe de souris naïves.
Le profil de cytokines trouvées chez ces patients en arrêt cardiaque semble être comparable à celui des patients en choc septique, exception faite pour l’IL1ra pour laquelle on trouve des taux beaucoup plus élevés que chez les patients septiques.
Pour les autres acteurs anti-inflammatoires telles que l’IL-10 et le soluble receptor TNF, les taux sont peu différents alors que l’on ne retrouve de TNFa dans aucun des 2 groupes, ce qui est contraire aux patients en choc septique.
Pour les cytokines pro-inflammatoires comme l’IL-8 et l’IL-6, on en retrouve dans les deux groupes en quantité similaire. On sait aussi qu’un taux élevé de ces cytokines a une valeur pronostique défavorable quant à la survie des patients. Pour le cas des malades en arrêt cardiaque, il semblerait que le devenir de ceux ayant de forts taux de ces cytokines en fin de suivi soit défavorable.
Ces dosages sont à compléter en incluant d’autres malades en arrêt cardiaque pour que des statistiques soient réalisées et que des conclusions soient établies.
Ce stage m’a tout d’abord permis de découvrir et de me familiariser avec le monde du travail et plus particulièrement celui d’un laboratoire de recherche. Pendant ce stage j’ai pu mettre à profit mes acquis pratique qui, malgré une lenteur certaine au début, ont donné des résultats de manipulation corrects (voir annexe B4). Le travail en collaboration avec d’autres personnes a contribué à compléter ma formation technique mais aussi théorique en utilisant d’autres méthodes de travail, de calcul. Lors d’un travail en collaboration autonome avec un médecin venant réaliser ses propres recherches au laboratoire 301 et encore peu familiarisé avec toutes les techniques de laboratoire, j’ai à mon tour pu apporter quelques connaissances quant aux gestes techniques par exemple.
ANNEXES
A1 : Plan de l’Institut *
A2 : Organigramme de l’Institut après restructuration *
A3 : Rôles des directions *
B1 : Pipettes Biohit® *
B2 : Photos 1 *
B3 : Photos 2 *
B4 : Test qualité dosage *
A2 : Organigramme de l’Institut après la restructuration de février 2000
LA DIRECTION GÉNÉRALE
Le Directeur Général :
Le Directeur Général, représentant légal de l’Institut Pasteur, est responsable de la politique générale de l’Institut et de son bon fonctionnement. Il prend les décisions nécessaires à la mise en place de cette politique. Il est assisté dans ses fonctions par les autres membres du Comité Exécutif, il est le supérieur hiérarchique direct des chefs de Département. Il préside le Comité Exécutif ainsi que le Conseil Stratégique Interne.
Le Directeur Général Adjoint pour l’Administration et les Finances :
Il assiste le Directeur Général pour les questions touchant aux affaires non scientifiques et notamment aux affaires administratives et financières, sans avoir d’autorité hiérarchique sur les autres directeurs concernés. Il participe aux réunions du Conseil d’Administration.
Le Directeur Général Adjoint pour la recherche, l’enseignement et la santé publique :
Il assiste le Directeur Général dans la conduite des affaires de nature scientifique et médicale, sans avoir d’autorité hiérarchique sur les autres directeurs concernés. Il participe aux réunions du Conseil d’Administration.
LES DIRECTEURS :
La direction Administrative et Financière (DAF) :
Le Directeur Administratif et Financier est responsable de la préparation du budget et de son exécution, de la politique financière et de sa mise en œuvre, de la gestion de la comptabilité et de la paye.
Il est le supérieur hiérarchique des gestionnaires. Il est responsable de la gestion du patrimoine de l’Institut Pasteur. Il est responsable de la logistique générale : achats, approvisionnements, expéditions, services d’entretien, ateliers et travaux.
La Direction Juridique (DJ) :
Le directeur juridique est responsable de l’ensemble des affaires juridiques concernant l’Institut Pasteur, à l’exception de celles qui relèvent du droit du travail. Il est responsable de la protection des marques appartenant à l’Institut Pasteur et a pour mission de prendre en charge les aspects réglementaires des dossiers qui le nécessitent (produits, expertises,...)
La Direction de la Valorisation et des Partenariats Industriels (DVPI) :
Le directeur de la Valorisation et des Partenariats Industriels est chargé de mettre en place et de développer une politique de valorisation des activités de l’Institut et de la marque " Institut Pasteur ". Il est responsable de la protection et de la valorisation des résultats issus de la recherche pasteurienne. Il est chargé des partenariats industriels. Il a sous son autorité les bureaux ou services en charge des Transferts et Technologie, des Accords et Licences, de Brevets et Inventions, et des Contrôles de gestion afférents.
La Direction des ressources Humaines (DRH) :
Le Directeur des ressources humaines a pour mission de contribuer au développement de l’Institut par une gestion adaptée des personnels et des organisations, à l’exception des domaines confiés à la Direction des Carrières Scientifiques (DCS). Le DRH coordonne les fonctions de recrutement et de gestion des carrières, de formation et de développement social, de gestion administrative du personnel, des relations sociales, d’hygiène, de sécurité, d’environnement et de médecine du travail.
La Direction des Carrières Scientifiques (DCS) :
Le Directeur des Carrières Scientifiques assure la gestion (recrutement et déroulement de carrière) du personnel scientifique de l’Institut. Il porte une attention particulière à la mobilité de ces personnels, en relation avec la DRH et la Direction des Relations avec les Institutions Publiques (DRIP) et le chargé de mission pour l’Enseignement. Il est responsable, en coordination avec la DRH, de la gestion des stagiaires scientifiques.
La Direction des Relations avec les Institutions Publiques (DRIP) :
Le Directeur des Relations avec les Institutions Publiques (DRIP) est en charge tant au plan de la recherche, que de l’enseignement des relations entre l’Institut Pasteur et les Institutions Publiques, tout particulièrement le Ministère de la Recherche et de l’Enseignement, les organismes publics de recherche (CNRS, INSERM, INRA,...) et les universités.
La Direction de la Coordination et des Programmes Transversaux de Recherche (DCP) :
Le Directeur de la Coordination et des Programmes Transversaux de Recherche a pour mission de planifier les actions définies par la Direction et d’assurer le suivi des décisions qui impliquent de façon transversale plusieurs Directions.
La Direction des Ressources Opérationnelles (DRO) :
Le Directeur des Ressources Opérationnelles est chargé de gérer sur le campus, les ressources opérationnelles nécessaires à l’exécution des missions fondamentales de l’Institut, en matière de Recherche, d’Enseignement et de Santé Publique. Le DRO a pour mission de superviser au plan technique la gestion du Centre d’Information Scientifique et la Résidence des stagiaires. Il est en outre chargé de programmer l’utilisation optimale des locaux dévolus à la Recherche.
La direction des Equipements et Technologies Stratégiques (DETS) :
Le DETS est responsable de la mise en place et de la gestion des équipements et technologies stratégiques pour le développement de la Recherche. Il supervise l’informatique scientifique, la génopole, ainsi que les services technologiques de pointe (Résonance Magnétique Nucléaire, spectrométrie de masse, microscopie électronique et confocale, analyse d’image, cytométrie de flux et microséquençage des protéines,...).
La Direction de la Communication (DIRCOM) :
Le directeur de la Communication a pour mission de développer la communication interne et externe de l’Institut Pasteur, et de diffuser son image tout en veillant à sa qualité. Il est ainsi responsable des relations avec les médias et des systèmes de communication internes et externes. Il préside le Comité éditorial du site Internet. Il est en outre responsable de toutes les opérations de mécénat, et notamment des dons et legs. Il est enfin responsable du musée de l’Institut Pasteur.
La Délégation au Réseau International des Instituts Pasteur et Instituts Associés :
Le Délégué Général au Réseau International des Instituts Pasteur et Instituts Associés est chargé de l’ensemble des relations avec les Instituts Pasteur et Instituts Associés dans le monde.
Le Conseil Extérieur d’Orientation Scientifique et Stratégique (CEOSS) :
Le CEOSS comprend 6 ou 7 membres nommés par le Directeur Général pour 4 ans, après avis du Conseil Scientifique. Constitué de personnalités tout extérieures à l’Institut Pasteur, il a pour mission d’analyser les orientations scientifiques et stratégiques de l’Institut. Il rend ses avis au Directeur Général qui les transmet au Président du Conseil d’Administration.
Afin de contrôler et valider mes compétences techniques en début de stage, j’ai effectué des dosages en parallèle de ceux ma maître de stage. Ainsi, par comparaison des résultats obtenus, mon travail à été jugé correct, ce qui a permis par la suite de
me confier différentes étapes des dosages.
